二、方法

2.1. 中宇宙的實驗方法

海水是從墨西哥灣收集的，用于填充 12 罐，每個 130 L，其中 4 個處理一式三份： 對照（海水）、WAF（用 Macondo 替代油，一種輕質(zhì)低硫原油，化學(xué)性質(zhì)類似于 在深水期間從 Macondo 井中溢出的石油 Horizon 事件）、CEWAF（Corexit + oil 比例為 1:20）和 DCEWAF （CEWAF 稀釋十倍）。 仔細(xì)描述了中間宇宙的設(shè)置 在韋德等人。 (2017) 以及準(zhǔn)備 WAF 的程序， CEWAF 和 DCEWAF。 簡而言之，注入油或油 + Corexit 進(jìn)入帶擋板的再循環(huán)罐并混合約 24 小時，然后將下層 分?jǐn)?shù)（即，避免表面光滑）被添加到各自的 坦克。 有關(guān)中宇宙實驗的信息在表 1 中給出 根據(jù)估計值添加初始和最終油濃度 根據(jù) Wade 等人確定的油當(dāng)量 (EOE)。 （2011 年，2017 年）。 實驗持續(xù) 3 到 5 天，運行 12:12 明暗循環(huán)。 在表 1 中，對于使用沿海 用微生物濃縮物修正的水域，浮游生物（≥63 μm）是 用網(wǎng)收集并轉(zhuǎn)移到聚碳酸酯瓶中。 這個 將濃縮的浮游生物塊引入罐中并攪拌（2 L 到每個）在開始實驗之前。 對于公海水域和沿海水域的中宇宙，營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行了修正， 添加營養(yǎng)物（最終濃度 f/20）并攪拌罐。

表格1 中觀的實驗設(shè)計。

本研究的樣品是從水柱中提取的 24 小時，根據(jù) Xu 等人詳細(xì)介紹的方法進(jìn)行分析。 （2018a，2018b）。 簡而言之，對于本研究，從水中提取的樣品等分試樣 通過 0.45 μm FlipMate 以 < 100 mmHg 的壓力輕輕過濾色譜柱 去除顆粒的裝置 (Environmental Express SC0301C)。 這 然后在 3 kDa 超速離心膜（Amicon Ultra-15，EMD # UFC900396）中處理 0.45 μm 濾液以收集膠體（3 kDa 截留物）級分。 收集 3 kDa 截留物并 用 18 MΩ -cm 沖洗 3 次，直到最終體積至少濃縮 25 倍。 這種 EPS 膠體部分來自水中 然后將 < 0.45 μm 和 > 3 kDa 的色譜柱用于本工作中提到的大多數(shù)測量。 測量每個EPS膠體樣品 對于蛋白質(zhì)和多糖，如下所述，并用 3 kDa 超濾滲透液（真正溶解的部分；濾液） 3 kDa 超濾器）來自用于測量的對照處理 SFT 以保持原始中宇宙樣本的離子組成。

2.2. 化學(xué)品和實驗室器具準(zhǔn)備

除非另有說明，所有化學(xué)品均來自 Sigma 并且是 97% 純 ACS 級或更高。 除非使用的水是天然海水，否則所有使用的水都是 18 MΩ –cm Milli-Q I 型水。 除非 指定，ASW（Millero 1996，第 67 頁），單個組件 MgCl2、NaCl 和 Na2SO4 在 450°C 下燃燒 4 小時。 所有實驗室用品 用自來水沖洗三次，在 1% 的溶液中浸泡 12 小時。 Micro-90® 肥皂溶液（VWR，目錄號 89210-140），用 18 MΩ –cm Milli-Q 水，在 3 M HCl 中浸泡 12 小時，并沖洗三次 18 MΩ –cm Milli-Q 水。 如果使用玻璃器皿，則另外 在 450 °C 下燃燒 4 h。

2.3. 標(biāo)準(zhǔn)生物大分子實驗

為了評估蛋白質(zhì)和多糖（單獨 或組合）在 SFT 上，實驗是在人工 海水，ASW，使用牛血清白蛋白（BSA，來自 Pierce 蛋白 檢測試劑盒，ThermoFisher），其等電點 pI 為 4.7–5.4 （視情況而定）。 此外，為了代表多糖，我們 使用過存在于水中的葡萄糖醛酸（Sigma，CAS 6556-12-3） 墨西哥灣柱（Hung 等人，2003 年；Xu 等人，2011 年）。 它是一個 具有與 D-甘露糖醛酸相似物理化學(xué)性質(zhì)的差向異構(gòu)體和 L-古洛糖醛酸，海藻酸的主要成分和豐富的 細(xì)菌外聚合物、生物膜和褐藻的成分。 葡萄糖醛酸的 pKa 為 2.8-3.2（取決于分子構(gòu)型）。 在 pH 值為 ~8 的 ASW 中，這些部分將被去質(zhì)子化，這將增強它們的表面反應(yīng)性。

2.4. 表面張力

SFT 使用 Kibron EZ Pi-Plus 張力計測量，該張力計 采用 Du Nouy-Paddy 技術(shù)結(jié)合 0.5 mm 直徑探針（Padday 等人，1975 年）。 探針是金屬合金的 一種親水性氧化物，與樣品的接觸可以忽略不計。 這 聚丙烯杯中的 1.5 mL 樣品使用循環(huán)水浴保持在 22.5 ± 0.3 °C 的恒溫。 探針是 通過用丁烷炬燃燒來清潔樣品之間。 每個 樣品至少測量四次，重復(fù)測量顯示 ≤ 5% 的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (RSD)。 這 儀器針對 18.2 MΩ –cm 電阻率 I 型水進(jìn)行校準(zhǔn)。 疏水部分的濃度越高 EPS 膠體分?jǐn)?shù)越低，表面張力越低。 因此，由于聚丙烯杯可能會吸附樣品中分子的更多疏水成分，因此實際的表面張力可能 低于表觀測量值，因此我們的測量值是 保守的。

2.5. 蛋白質(zhì)和多糖測定

EPS 中的蛋白質(zhì)含量是基于改良的二辛可寧酸方法（Smith 等人，1985 年）使用 Pierce 蛋白質(zhì)測定的 檢測試劑盒（ThermoFisher），以 BSA 為標(biāo)準(zhǔn)。

使用蒽酮方法（Morris 1948）測定中性糖濃度，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)。 對于蒽酮試劑，0.05 g 蒽酮（CAS 90-44-8；終濃度 1 g/L 蒽酮）溶于 50 mL 濃硫酸中 玻璃燒杯，然后攪拌。 在每次應(yīng)用此方法之前立即制備蒽酮試劑。 對于葡萄糖 標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將 50 mg 葡萄糖（CAS 50-99-7；終濃度 1 g/L 葡萄糖）溶解在 50 mL 離心管中，然后填充 用 Milli-Q 水定容至 50 mL。 標(biāo)準(zhǔn)品的儲備溶液是 稀釋至最終體積 10 mL，例如，對于 5 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)品 溶液，0.05 mL 儲備溶液，用 9.95 mL Milli-Q 水稀釋。 然后抽取各標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1 mL 和樣品 0.1 mL 放入單獨的 Pyrex 玻璃管中。 我們向每個管中添加了 0.2 mL 蒽酮試劑溶液并在 100°C 下加熱 10 分鐘。 之后 孵育，試管立即在冰浴中冷卻或 運行自來水，使它們迅速達(dá)到室溫。 這 在光電色度計中在 620 nm 處測量光密度。 該方法用于測定中性糖； 它不會 檢測帶電糖，如糖醛酸。

通過添加硼酸鈉 (75 mM) 來估計糖醛酸 濃硫酸和間羥基二苯，含葡萄糖醛酸 酸作為標(biāo)準(zhǔn)（Hung 和 Santschi 2001）。

蛋白質(zhì)、中性糖和糖醛酸的濃度， 以 BSA、葡萄糖和葡萄糖醛酸當(dāng)量表示，相對于溶解的有機碳（蛋白質(zhì) 53%，40% 中性糖，糖醛酸 37%）。 然后蛋白質(zhì)與多糖的比例計算為蛋白質(zhì)/TCHO，其中TCHO（總 碳水化合物=中性糖+糖醛酸）。 因此，蛋白質(zhì)：多糖的比例是（蛋白質(zhì) * 0.53）/[（中性糖 * 0.40）+（糖醛酸 酸 * 0.37），其中所有濃度均以 mg-OC/L 為單位（OC 是有機的 碳）。 EPS 組成和濃度計算公式為 從三個復(fù)制的中胚層罐中收集的樣品 每個處理（n = 3）。

2.6. 溶解有機碳測定

DOC 的濃度是在 Shimadzu TOC-L 分析儀上使用高溫燃燒法測量的（Xu 等人，2011 年；Guo 等。 1994）。 來自 0.7 um 預(yù)燃 Whatman GFF 的樣品濾液 用 2N HCl 溶液將膜酸化至 < pH 2，然后吹掃 用純空氣吹 10 分鐘以去除無機碳。 樣本是 然后在 680 °C 下燃燒并進(jìn)行 CO2 測量以確定碳量。 為了計算 DOC 濃度， 減去系統(tǒng)空白并根據(jù)校準(zhǔn)計算 曲線使用羥基鄰苯二甲酸鉀作為標(biāo)準(zhǔn)。 樣品 波動系數(shù)超過 3% 測量 3 次， 給出最低波動因子的兩個值的平均值是 采納。

2.7. 共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM)

共聚焦激光掃描顯微鏡圖像是用 蔡司 LSM 880 共聚焦光譜顯微鏡成像系統(tǒng)，使用 Zstack 軟件。 所有樣品均使用人工海水制備 (ASW) 購自 Sigma（S9883 海鹽）并以 40 g/L 配制。 為了制備 WAF，將 200 μL Macondo 替代油緩慢加入到 在 500 mL 硼硅玻璃制成的瓶子中過濾 ASW 海水 帶有特氟龍襯里的帽子。 攪拌混合物并使其平衡24小時以制備WAF。 CEWAF 的制作方式相同，除了 在混合之前，Corexit 以 1:20 的 Corexit 與油的比例添加 與 ASW（Chiu 等人，2017 年；Wade 等人，2017 年）。 Corexit 治療 除了將 Corexit 添加到 ASW 組成 0.1% 的溶液。 溶液終濃度 BSA 和海藻酸 (Sigma, CAS 9005-38-3) 的濃度也為 0.1%。 這 將 500 mL 處理液倒置幾次，然后將 20 μL 等分試樣移液到載玻片上，與 100 mM 金霉素孵育 (CTC, Sigma CAS 64-72-2) 染料溶液在每次處理約 30分鐘。 如染料分布所示，分子擴散在小體積內(nèi)快速。 圖像是在激發(fā)/發(fā)射 495 nm/519 nm 在 1 毫秒的時間內(nèi)。

2.8. 掃描電子顯微鏡 (SEM)

SEM 樣品首先過濾到 0.03 um 聚碳酸酯上 跟蹤蝕刻膜過濾器（SPI Supplies, West Chester, PA, USA），然后 使用 4% 多聚甲醛固定，然后用磷酸鹽緩沖鹽水 (PBS) 洗滌，然后用去離子水沖洗（Tsai 等人，2017 年）。 使用 30%、50%、75%、95% 和 100% 的甲醇完成脫水（Tsai 等人，2017 年）。 使用 CO2 臨界點干燥器去除 任何殘留溶劑。 最后，在上面濺射鍍上一層薄薄的金 這些基材。 然后使用 FEI Quanta 200 獲取圖像 ESEM 系統(tǒng)（Tsai 等人，2017 年）。

蛋白質(zhì)外聚物中多糖的比例——摘要、簡介

蛋白質(zhì)外聚物中多糖的比例——方法

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