一、微流控與微流控芯片

微流控（Microfluidics）的含義是微尺度下的流體控制，其研究對(duì)象是使用微米級(jí)通道操控納升級(jí)以下微量液體的系統(tǒng)[1-3]。鑒于芯片是實(shí)現(xiàn)微流體控制的主要平臺(tái)，因而微流控芯片（Microfluidic chip）是微流控的主要研究內(nèi)容。

微流控芯片的制作主要依托于MEMS（Micro-Electro-Mechanical System）加工工藝，具有在微米尺度級(jí)別實(shí)現(xiàn)微量流體操控的能力。微流控芯片技術(shù)的特點(diǎn)來自于兩個(gè)方面：一是微流體的特性微尺度下流體的一系列特殊效應(yīng)包括層流效應(yīng)、表面張力及毛細(xì)效應(yīng)、快速熱傳導(dǎo)效應(yīng)和擴(kuò)散效應(yīng)等，這些效應(yīng)有利于精確流體控制和實(shí)現(xiàn)快速反應(yīng)；二是微加工工藝帶來的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性微加工工藝具有加工小尺寸、高密度微結(jié)構(gòu)的能力，便于實(shí)現(xiàn)各種操作單元的靈活組合與規(guī)模集成。因此，樣品前處理、分離與分析、檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)流程得以在同一芯片上集成化和并行化，從而達(dá)到微型化、自動(dòng)化、低消耗和高效率的目的[4,5]。

微流控研究起始于20世紀(jì)90年代，至今已經(jīng)有二十余年的發(fā)展歷史，其間經(jīng)歷了基礎(chǔ)理論奠定、單元操作技術(shù)發(fā)展、小規(guī)模集成和大規(guī)模集成幾個(gè)歷史發(fā)展階段。至今，微流控技術(shù)已經(jīng)較為成熟，已經(jīng)在多個(gè)領(lǐng)域得到認(rèn)可并廣為利用,其產(chǎn)業(yè)化趨勢(shì)亦是愈發(fā)明顯[6]。2003年《福布斯》雜志把這項(xiàng)技術(shù)評(píng)為“影響人類未來15件最重要發(fā)明之一”；2004年，美國Business 2.0雜志封面文章將微流控芯片列為“改變世界”的七種技術(shù)之一；2006年Nature雜志出版了一期微流控專輯，題名為“本世紀(jì)的技術(shù)”。

二、微流控體外診斷技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

體外診斷（In vitro diagnosis,IVD），是指對(duì)人體的體液和組織等進(jìn)行檢測(cè)而獲得臨床診斷信息。微流控芯片是體外診斷的有利技術(shù)平臺(tái)[7,8]，這表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：1.應(yīng)用場(chǎng)景拓展傳統(tǒng)的檢驗(yàn)設(shè)備多為大型儀器，雖然在測(cè)試通量和穩(wěn)定性上具有優(yōu)勢(shì)，但其使用局限于專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。微流控芯片系統(tǒng)體積小巧、操作簡單，完全可以在門急診、基層醫(yī)療單位甚至床邊進(jìn)行檢測(cè)，這極大地拓展了體外診斷的應(yīng)用空間；2.分析效率的提高集成化和并行化設(shè)計(jì)的微流控芯片系統(tǒng)，有能力在短時(shí)間內(nèi)提供更為豐富的診斷信息，因而顯著提升了分析效率；3.測(cè)試成本的下降微流控芯片使用微反應(yīng)體系，能夠大幅降低試樣消耗從而降低測(cè)試成本[9]。概括來講，微流控體外診斷技術(shù)的優(yōu)勢(shì)可以歸結(jié)為多、快、好、省四個(gè)字，這種分析技術(shù)無疑是對(duì)現(xiàn)有體外診斷技術(shù)的巨大提升。

微流控體外診斷技術(shù)已經(jīng)引起了國家層面的重視。2016年國務(wù)院“十三五”國家科技創(chuàng)新規(guī)劃中關(guān)于體外診斷產(chǎn)品的章節(jié)寫到“突破微流控芯片等關(guān)鍵技術(shù)，開發(fā)全自動(dòng)核酸檢測(cè)系統(tǒng)等一批重大產(chǎn)品，研發(fā)一批重大疾病早期診斷和精確治療診斷試劑以及適合基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)的高精度診斷產(chǎn)品，提升我國體外診斷產(chǎn)業(yè)競(jìng)爭(zhēng)力”。由此可見，微流控體外診斷技術(shù)的發(fā)展已經(jīng)上升到國家戰(zhàn)略層面。

作者所在研究團(tuán)隊(duì)工作于臨床檢驗(yàn)第一線，課題組的研究方向是針對(duì)臨床檢驗(yàn)中的痛點(diǎn)問題發(fā)展創(chuàng)新微流控診斷技術(shù)。經(jīng)歷了十余年的研究歷程，課題組對(duì)于微流控體外診斷技術(shù)在臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用價(jià)值逐步加深了理解。本文中就課題組對(duì)于微流控技術(shù)的理解以及我們的一些體外診斷應(yīng)用嘗試與大家分享，希望能夠?qū)z驗(yàn)醫(yī)學(xué)同仁有所幫助。

三、微流控芯片技術(shù)在體外診斷領(lǐng)域的應(yīng)用嘗試

當(dāng)前，傳統(tǒng)的體外診斷技術(shù)已經(jīng)極為成熟。微流控體外診斷產(chǎn)品若要進(jìn)入體外診斷市場(chǎng)，勢(shì)必要展示出高人一籌的能力。相比較傳統(tǒng)的宏觀檢驗(yàn)設(shè)備，微流控產(chǎn)品最大的市場(chǎng)拓展?jié)摿υ谟冢?.針對(duì)傳統(tǒng)產(chǎn)品無法適用的應(yīng)用環(huán)境開發(fā)產(chǎn)品；2.發(fā)展性能指標(biāo)和操作便利性具有明顯優(yōu)勢(shì)的顛覆性新產(chǎn)品。一個(gè)成功的微流控體外診斷產(chǎn)品，需要在操作便利性、分析速度、分析通量和測(cè)試成本等幾個(gè)方面達(dá)到平衡。以下，我們就課題組在幾個(gè)關(guān)鍵的臨床檢驗(yàn)應(yīng)用領(lǐng)域的研究工作加以介紹。

（一）分子診斷

分子診斷是新興的檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。隨著熒光定量PCR的推廣，基因檢測(cè)技術(shù)在臨床醫(yī)學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用。盡管如此，現(xiàn)有核酸分析平臺(tái)的一些不足之處還是限制了分子診斷技術(shù)的推廣：1）場(chǎng)地要求嚴(yán)格，試劑準(zhǔn)備、核酸提取和擴(kuò)增需要分別在獨(dú)立房間內(nèi)進(jìn)行，極大限制了該技術(shù)在醫(yī)療資源有限條件下的開展；2）采用離線式分析，操作復(fù)雜、分析周期較長，不利于應(yīng)對(duì)突發(fā)性事件；3）現(xiàn)有的熒光定量PCR方法多是針對(duì)單一指標(biāo)檢測(cè)設(shè)計(jì)，對(duì)于多重基因檢測(cè)無論是操作繁瑣程度還是測(cè)試成本均是難以接受的。

分子診斷是微流控芯片技術(shù)最具有代表性的應(yīng)用領(lǐng)域。對(duì)于分子診斷應(yīng)用，微流控芯片最大的貢獻(xiàn)在于該技術(shù)有潛力將核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)集成于同一裝置，因而可擺脫繁瑣操作以及對(duì)專業(yè)實(shí)驗(yàn)室的依賴。此外，由于反應(yīng)過程處于封閉的環(huán)境中，可以消除交叉污染的可能性。除了功能集成，微流控核酸分析芯片還需要具有一定的分析通量以滿足臨床實(shí)際需求。已經(jīng)商業(yè)化的微流控分子診斷產(chǎn)品基本都是針對(duì)病原微生物檢測(cè)應(yīng)用，其價(jià)值在于：1.實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)；2.解決難于培養(yǎng)鑒定病原（如結(jié)核桿菌、病毒、支原體等）鑒定問題。

作者課題組最近發(fā)展一種液滴陣列微流控芯片核酸分析系統(tǒng)[10]。這種便攜式系統(tǒng)包含機(jī)械、磁力和光學(xué)檢測(cè)單元，其設(shè)計(jì)理念是平衡集成、通量、成本及便攜性等關(guān)鍵因素，發(fā)展適合于現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用的病原篩查工具。系統(tǒng)所用微流控芯片上設(shè)計(jì)有多組以狹縫通道連通的串聯(lián)微池，全部分析試劑均以油包水形式預(yù)存儲(chǔ)于其中。由于表面張力效應(yīng)，油相可以浸潤微池和狹縫而水相不能。利用磁鐵陣列驅(qū)動(dòng)磁珠在串聯(lián)液滴中穿行，程序化完成細(xì)胞裂解-核酸結(jié)合、磁珠洗滌、核酸洗脫、擴(kuò)增/檢測(cè)等一系列步驟，從而實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和平行化核酸分析。該系統(tǒng)極為緊湊，適合于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)及醫(yī)院門急診場(chǎng)景下的“隨到隨檢、快速響應(yīng)”需求。課題組將這一系統(tǒng)用于性傳播疾病病原篩查，淋病奈瑟菌、沙眼衣原體、解脲脲原體、生殖支原體等四種病原的篩查可在45 min內(nèi)完成。

圖1液滴陣列微流控芯片核酸分析系統(tǒng)。A.分析儀器實(shí)物及結(jié)構(gòu)示意圖;B.分析原理示意圖。

（二）免疫檢測(cè)

免疫檢測(cè)是臨床檢驗(yàn)極為重要的領(lǐng)域。目前，臨床免疫檢測(cè)的主流技術(shù)是化學(xué)發(fā)光和免疫比濁法，具有靈敏度高和檢測(cè)線性范圍寬的優(yōu)勢(shì)。這些檢測(cè)方法一般使用大型儀器，分析通量較高。但是，由于購置成本和儀器體積因素，這類設(shè)備僅適合于大型實(shí)驗(yàn)室使用?；谠嚰垪l的膠體金法是快速免疫檢測(cè)的主流技術(shù)，該技術(shù)雖然使用方便，但在靈敏度和線性范圍方面受限。因此，臨床檢驗(yàn)工作需要一種兼具操作便利性、檢測(cè)靈敏度和定量準(zhǔn)確性的免疫檢測(cè)平臺(tái)，這對(duì)于急診以及基層醫(yī)療單位尤其重要。

圖2液滴陣列微流控芯片免疫分析系統(tǒng)。A.分析儀器結(jié)構(gòu)示意圖;B.分析原理示意圖。

作者課題組發(fā)展了一種微流控芯片免疫化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)[10]。與前面介紹的液滴陣列微流控芯片核酸分析系統(tǒng)類似，免疫化學(xué)發(fā)光分析系統(tǒng)采用具有平行串聯(lián)微池結(jié)構(gòu)的微流控芯片。免疫化學(xué)發(fā)光分析相關(guān)的一組試劑以油包水液滴形式預(yù)存儲(chǔ)于指定微池中。由于表面張力效應(yīng)，狹縫可以隔絕水相溶液。通過程序化的磁力操控，在液滴間轉(zhuǎn)移磁珠，從而將化學(xué)發(fā)光免疫分析涉及的一系列操作，包括抗原-抗體結(jié)合、磁珠洗滌、酶促發(fā)光及信號(hào)檢測(cè)，在芯片分析系統(tǒng)內(nèi)自動(dòng)完成。研究利用發(fā)展的微流控化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，進(jìn)行了C反應(yīng)蛋白(CRP)與降鈣素原(PCT)兩種感染性疾病標(biāo)記物的同步檢測(cè)。在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，整個(gè)過程可在15 min內(nèi)完成。CRP與PCT檢測(cè)限分別為0.31 ng?mL-1和0.09 ng?mL-1，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍分別為0.8-200 ng?mL-1和0.5-60 ng?mL-1，對(duì)照測(cè)試提示微流控芯片系統(tǒng)與商品化儀器檢測(cè)結(jié)果高度一致。

（三）病原微生物檢測(cè)

病原微生物檢測(cè)主要包括病原鑒定和藥物敏感性判定兩個(gè)方面。目前，臨床微生物檢測(cè)面臨的最大問題就是檢測(cè)周期過長。感染性疾病大多病情兇險(xiǎn)，需要及時(shí)診斷和治療，留給病原檢測(cè)的時(shí)間窗口只有30分鐘左右。然而，目前的病原微生物鑒定和藥物敏感性判定的典型周期是2-3天，這顯然難以滿足臨床需求。病原檢測(cè)技術(shù)的限制所帶來的結(jié)果是，一方面經(jīng)驗(yàn)性診斷的準(zhǔn)確性難于保證，另一方面抗生素濫用引發(fā)了嚴(yán)重的耐藥問題。

微流控技術(shù)對(duì)于病原微生物鑒定的解決方案多是采用核酸檢測(cè)策略，這在前面部分已經(jīng)敘述。鑒于藥物敏感性(Antimicrobial Susceptibility Testing,AST)判定的實(shí)質(zhì)是病原在藥物暴露條件下的增殖情況判定，微流控技術(shù)采用的策略是：1.通過培養(yǎng)器體積的減小，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)信號(hào)的相對(duì)富集；2.使用更為精準(zhǔn)的病原定量技術(shù)。這兩種策略均可以通過縮短病原培養(yǎng)時(shí)間實(shí)現(xiàn)快速的藥物敏感性判定。遵循這種理念，作者課題組發(fā)展了一種基于液滴陣列微流控芯片的數(shù)字化抗生素敏感性測(cè)試方法[11]。我們的設(shè)想是借助于數(shù)字化分析的精準(zhǔn)定量能力顯著縮短細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間。細(xì)菌懸液與抗生素孵育后引入微流控芯片完成液滴發(fā)生和捕獲，生成高密度微液滴陣列。通過對(duì)液滴陣列進(jìn)行熒光掃描成像，檢測(cè)每個(gè)液滴中的熒光信號(hào)并以此計(jì)算出細(xì)菌存活率（v）和陽性微液滴比例（p）。根據(jù)陽性微液滴比例，可以泊松分布算法推算出細(xì)菌密度,依據(jù)細(xì)菌密度變化可確定最小抑菌濃度（minimuminhibitory concentration,MIC）。我們的初步研究結(jié)果顯示應(yīng)用該方法僅需30 min抗生素暴露時(shí)間即可判定大腸桿菌的抗生素敏感性。

圖3A.液滴微流控芯片原理設(shè)計(jì)圖結(jié)構(gòu)包含上游的液滴生成區(qū)和下游的液滴捕獲區(qū)；B.利用液滴熒光成像分辨細(xì)菌陽性和陰性液滴；C.液滴數(shù)字化分析顯示健康人和尿路感染病人尿液細(xì)菌計(jì)數(shù)差別；D.液滴數(shù)字化分析顯示敏感和耐藥細(xì)菌對(duì)于抗生素的反應(yīng)。

（四）細(xì)胞水平抗腫瘤藥物敏感性測(cè)試

體外抗腫瘤藥物敏感性測(cè)試是指導(dǎo)抗腫瘤藥物合理使用的有效手段。雖然基因檢測(cè)可以用來預(yù)測(cè)抗腫瘤藥物敏感性，然而該方法存在一定的不確定性。相比之下，細(xì)胞水平的藥物測(cè)試仍然是判定抗腫瘤藥物敏感性更為直接可靠的手段。然而，由于細(xì)胞水平抗腫瘤藥物敏感性測(cè)試存在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異大、測(cè)試通量有限以及操作難于標(biāo)準(zhǔn)化等問題，至今在臨床難以推廣。

針對(duì)該問題，課題組開發(fā)了一套微流控腫瘤微陣列藥物測(cè)試系統(tǒng)[12]，其核心是一種復(fù)合式結(jié)構(gòu)開放式微流控芯片。芯片頂層是開放式儲(chǔ)液池，底層是細(xì)胞培養(yǎng)池陣列，中間層是納米孔薄膜。利用納米孔薄膜不允許液體通過只允許跨膜擴(kuò)散的特性，將其用做止流閥實(shí)現(xiàn)細(xì)胞懸液自動(dòng)分配以及用作擴(kuò)散屏障仿真血管內(nèi)皮層。配合移液工作站，這種微流控芯片可以實(shí)現(xiàn)藥物篩選所包含的長期細(xì)胞培養(yǎng)、換液、多藥物處理以及細(xì)胞存活檢測(cè)等一系列操作步驟。

研究利用自行設(shè)計(jì)加工的1010微流控細(xì)胞培養(yǎng)陣列芯片，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞培養(yǎng)陣列構(gòu)建、長期細(xì)胞培養(yǎng)、換液、多藥物處理以及細(xì)胞存活檢測(cè)等一系列功能。乳腺癌細(xì)胞在持續(xù)培養(yǎng)3天后增殖形成了類組織結(jié)構(gòu)。利用開放式微流控組織陣列芯片實(shí)現(xiàn)了3因素3水平正交藥物組合測(cè)試，并依據(jù)細(xì)胞存活率檢測(cè)結(jié)果篩選出最佳的抗乳腺癌藥物組合。研究結(jié)果顯示這種明微流控芯片能夠以高度仿真的組織實(shí)現(xiàn)多藥組合測(cè)試，因而有潛力成為指導(dǎo)腫瘤個(gè)體化精準(zhǔn)治療的有力工具。

圖4A.微流控腫瘤微陣列藥物測(cè)試系統(tǒng)包含一種復(fù)合式結(jié)構(gòu)開放式微流控芯片以及移液工作站；B.微流控芯片上腫瘤微環(huán)境重建的示意圖。3D培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞模擬腫瘤實(shí)質(zhì)，水凝膠模擬支持和滋養(yǎng)腫瘤細(xì)胞的腫瘤基質(zhì)，納米孔薄膜擴(kuò)散屏障模擬血管內(nèi)皮層；C.微流控芯片上連續(xù)三天內(nèi)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖情況。（Calcein-AM/EthD-1染色，比例尺：200μm）；D.抗腫瘤藥物正交組合測(cè)試結(jié)果。藥物測(cè)試包括LO2肝細(xì)胞和MCF-7乳腺癌細(xì)胞對(duì)A.阿霉素，B.紫杉醇和C.順鉑的3因素3水平正交組合藥物的反應(yīng)。

通過上述應(yīng)用實(shí)例，我們將微流控體外診斷技術(shù)的優(yōu)勢(shì)概括為：1.應(yīng)用場(chǎng)景的拓展；2.分析效率的提高；3.分析時(shí)間的縮短以及4.檢測(cè)精度的提升。由此可見，微流控芯片是極具優(yōu)勢(shì)的體外診斷技術(shù)平臺(tái)。

四、微流控體外診斷技術(shù)的機(jī)遇與挑戰(zhàn)

目前，我國正處于巨大的社會(huì)變革過程，一方面國力的增強(qiáng)和科技的進(jìn)步促進(jìn)了新技術(shù)的發(fā)展和推廣，另一方面新形勢(shì)對(duì)于體外診斷行業(yè)提出了新的要求。體外診斷作為一個(gè)高附加值行業(yè)，將會(huì)在未來相當(dāng)長的階段中快速發(fā)展，甚至成為國家的支柱產(chǎn)業(yè)。隨著醫(yī)療改革的推進(jìn)，三級(jí)醫(yī)療體系將逐漸完善，隨之而來的是醫(yī)療資源由集中轉(zhuǎn)變變?yōu)榉稚⒛Ｊ?。公立醫(yī)院的改革以及第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的興起，勢(shì)必會(huì)對(duì)體外診斷技術(shù)提出更高的要求。在這種形勢(shì)下，微流控技術(shù)將會(huì)對(duì)體外診斷行業(yè)的發(fā)展提供一個(gè)有利的契機(jī)。

現(xiàn)實(shí)中的微流控技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)程仍然是步履艱難。從技術(shù)角度來看，微流控體外診斷產(chǎn)品開發(fā)涉及多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域，包括醫(yī)學(xué)、生物、化學(xué)和工程等。任何一個(gè)企業(yè)，想要建立這樣一個(gè)規(guī)模的研發(fā)隊(duì)伍都絕非易事。作為微流控系統(tǒng)的核心，微流控芯片的設(shè)計(jì)、材料選擇、表面處理、芯片加工乃至包裝保存，都具有一定技術(shù)難度。因此，微流控產(chǎn)品的研發(fā)難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)體外診斷產(chǎn)品。從產(chǎn)業(yè)環(huán)境角度來看，研究、生產(chǎn)和應(yīng)用單位的脫節(jié)，高端加工技術(shù)的欠缺都增加了微流控產(chǎn)品開發(fā)的難度。此外，近期實(shí)體經(jīng)濟(jì)的低迷也導(dǎo)至企業(yè)對(duì)于這種高技術(shù)含量產(chǎn)品研發(fā)信心不足。對(duì)于微流控體外診斷產(chǎn)品開發(fā)，我們認(rèn)為以下幾個(gè)方面需要關(guān)注：首先是明確的市場(chǎng)定位，相比較傳統(tǒng)技術(shù)，微流控產(chǎn)品必須在某個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域或應(yīng)用場(chǎng)景下具有突出的優(yōu)勢(shì)；其次是前期研究基礎(chǔ)。由于微流控產(chǎn)品研發(fā)技術(shù)門檻較高，缺少扎實(shí)的研究基礎(chǔ)會(huì)增加開發(fā)進(jìn)程的不確定性；再者就是盡量規(guī)避技術(shù)制約。由于各種條件限制，某些類型芯片可能在一定階段內(nèi)不具備量產(chǎn)可行性。因此，我們對(duì)于微流控診斷產(chǎn)品開發(fā)的建議是：1.選擇恰當(dāng)?shù)膽?yīng)用對(duì)象；2.整合研發(fā)資源；3.開拓創(chuàng)造性的產(chǎn)學(xué)研合作模式。

五、結(jié)語

總體看來，微流控體外診斷技術(shù)的發(fā)展前途是光明的，道路是曲折的。無論如何，我們堅(jiān)信微流控技術(shù)是新形勢(shì)下應(yīng)對(duì)臨床檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)挑戰(zhàn)的有力工具，該技術(shù)勢(shì)必會(huì)對(duì)臨床檢驗(yàn)?zāi)芰Φ奶嵘鸬骄薮蟮耐苿?dòng)作用。

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