多種生物相關(guān)單分子膜呈現(xiàn)相共存，其特征是由分散在連續(xù)無(wú)序相中的有序相態(tài)脂質(zhì)形成的域。由于這些相之間表面密度的差異，產(chǎn)生了疇間偶極相互作用。這些相互作用與域的空間分布及其動(dòng)力學(xué)的確定有關(guān)。在這項(xiàng)工作中，我們提出了一種使用被動(dòng)方法估計(jì)偶極斥力的新方法，該方法涉及分析具有相位共存的單層的圖像。該方法基于實(shí)驗(yàn)獲得的配對(duì)相關(guān)函數(shù)與模型系統(tǒng)布朗動(dòng)力學(xué)模擬獲得的配對(duì)相關(guān)函數(shù)的比較。作為一個(gè)例子，我們通過(guò)分析磁疇的徑向分布來(lái)確定DSPC/DMPC二元單層在空氣-水界面上的偶極密度差異，并將結(jié)果與通過(guò)表面電位測(cè)定獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)參數(shù)范圍進(jìn)行了系統(tǒng)分析，該參數(shù)范圍可作為獲得不同系統(tǒng)中偶極斥力的工作曲線。

1、引言

在不同的生物膜中，經(jīng)常觀察到相共存，這取決于膜和水組成、溫度和膜的特定模型（朗繆爾單分子膜、支撐膜、獨(dú)立雙層，例如巨大的單層囊泡或黑色脂膜等）。當(dāng)致密相不是連續(xù)相時(shí)，觀察到域（某些脂質(zhì)成分稱為筏）在更流動(dòng)的相中移動(dòng)。這些結(jié)構(gòu)域相互作用1-4，這些相互作用影響其自身的運(yùn)動(dòng)4,5以及膜中其他物種的運(yùn)動(dòng)。6,7

疇間相互作用可能與靜電力（偶極或庫(kù)侖斥力）有關(guān)，這些靜電力與共存相的自發(fā)曲率和疇運(yùn)動(dòng)時(shí)出現(xiàn)的水動(dòng)力有關(guān)。這些力阻礙了結(jié)構(gòu)域的聚合，并在長(zhǎng)時(shí)間尺度上調(diào)節(jié)膜中物種的可用性及其動(dòng)力學(xué)。偶極斥力總是存在的，因?yàn)樾纬赡さ姆肿邮怯行虻暮团紭O的。庫(kù)侖力出現(xiàn)在帶電疇中，而當(dāng)共存相的自發(fā)曲率明顯不同時(shí)，曲率效應(yīng)很重要，對(duì)于具有高線張力的大疇。3.

偶極斥力可以通過(guò)界面上組織的表面活性劑的偶極密度差來(lái)估計(jì)，包括極性頭基團(tuán)區(qū)域中水合水的貢獻(xiàn)。8測(cè)定均勻膜的平均偶極矩（分子+水合水）值的一種常用方法是測(cè)定空氣-水界面處朗繆爾單分子膜的表面電位。9-11或者，在雙層膜中使用了對(duì)局部電位敏感的探針，以及電導(dǎo)測(cè)量。12因此，如果共存相的組成已知，則具有每個(gè)相組成的單層或雙層的偶極電勢(shì)可以估計(jì)每個(gè)相的偶極密度，從而估計(jì)它們之間的差異。

然而，共存相的組成并不總是容易獲得，尤其是對(duì)于含有兩個(gè)以上組分的系統(tǒng)，因此不可能通過(guò)偶極電位測(cè)量來(lái)估計(jì)偶極密度的差異。此外，當(dāng)單組分膜的相變形成疇時(shí)，在相同的溫度和分子密度下估計(jì)每個(gè)相的偶極電勢(shì)并不簡(jiǎn)單。

結(jié)構(gòu)域的存在是不同模型膜以及哺乳動(dòng)物（假定大小為納米）、13酵母、真菌和植物（半徑在微米范圍內(nèi)）的質(zhì)膜中的一個(gè)共同特征。14,15在這些自然系統(tǒng)中，膜的組成非常復(fù)雜，因此不可能知道域的精確組成，因此也無(wú)法從偶極電位測(cè)量中估計(jì)偶極密度的差異。

確定相共存單分子膜中偶極斥力的其他替代方法基于對(duì)疇平衡尺寸分布的分析。16,17 Mulder16提出的方法通過(guò)高斯近似精確的尺寸分布，并使用簡(jiǎn)化的理論分析，其中近似處理域間相互作用。另一方面，Lee等人17通過(guò)用平衡熱力學(xué)表達(dá)式擬合尺寸分布，獲得了過(guò)量偶極密度。他們的方案假設(shè)域之間沒(méi)有相互作用，因此對(duì)于充分稀釋的域是有效的。

在這項(xiàng)工作中，我們提出了一種使用被動(dòng)方法估計(jì)偶極斥力的新方法，該方法涉及分析具有相位共存的單層的圖像。我們利用了一個(gè)事實(shí)，即域之間的偶極斥力促進(jìn)了域的二維空間排列，其中平均域-域距離最大。因此，斥力將誘導(dǎo)疇分布，從而導(dǎo)致液體系統(tǒng)的徑向分布函數(shù)特性。18該方法基于將從實(shí)驗(yàn)中獲得的配對(duì)相關(guān)函數(shù)與模型系統(tǒng)的布朗動(dòng)力學(xué)模擬進(jìn)行比較。作為一個(gè)例子，我們通過(guò)分析磁疇的徑向分布來(lái)確定DSPC/DMPC二元單層在空氣-水界面上的偶極密度差異，并將結(jié)果與通過(guò)表面電位測(cè)定獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。

2、實(shí)驗(yàn)部分

混合二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC）和二吡啶酰磷脂酰膽堿（DMPC）單分子膜具有廣泛的組成和側(cè)壓力，其中它們表現(xiàn)出兩相液凝（LC）和液脹（LE）共存區(qū)域。在室溫下，混合單分子膜顯示分散在LE連續(xù)相中的LC微米級(jí)疇，側(cè)壓為10 mN m-1，DSPC的組成高于24 mol%。5.

我們使用熒光顯微鏡拍攝了不同DSPC濃度下混合單分子膜的顯微照片。我們使用DSPC、DMPC和親脂性熒光探針L-R-磷脂酰乙醇胺-N-（賴氨酸羅丹明B磺?；╀@鹽（雞蛋，反式磷脂酰化）（Rho-PE）進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，該探針購(gòu)自Avanti Polar Lipses（Alabaster，AL）。用于亞相的水來(lái)自Milli-Q系統(tǒng)（微孔），電阻率為18 MO-cm，表面張力為72 mN m-1。

熒光探針（Rho-PE）在以1 mol%或更低的濃度擴(kuò)散之前被并入脂質(zhì)溶液中。在純凈水亞相的朗繆爾槽（微槽XS，Kibron-Finnland）中形成單層。將脂質(zhì)混合物溶解在氯仿：甲醇（2:1）中，以獲得1 nmol ml 1的溶液，將其攤鋪在水表面。我們?cè)谑覝豑=（20±1）1C下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，并將薄膜壓縮至側(cè)向壓力p=（10±1）mN m-1，使用Wilhelmy方法測(cè)定Pt板。

在將脂質(zhì)層攤鋪在提升1.5倍的區(qū)域后，將亞相水平降低到約3 mm的厚度，以最小化對(duì)流。朗繆爾天平放置在倒置顯微鏡（Axiovert 200，蔡司）的工作臺(tái)上，該顯微鏡配有CCD IxonEM+型號(hào)DU-897（和或技術(shù)）攝像機(jī)、100物鏡、連續(xù)固態(tài)激光器（TEM00，532 nm至200 mW，Roithner Lasertech）和羅丹明發(fā)射濾波器。熒光探針優(yōu)先在LE相上分配，因此在凝聚相中由脂質(zhì)形成的區(qū)域在圖像中看起來(lái)更暗。

使用KSV NIMA表面電位傳感器（芬蘭赫爾辛基），采用振動(dòng)板法測(cè)定朗繆爾單分子膜中的表面電位。薄膜是用純DSPC（凝聚態(tài)的成分5）或含有24 mol%DSPC（膨脹相的成分5）的DSPC和DMPC的混合物制備的。

2.1、圖像分析和徑向分布函數(shù)

表征單層結(jié)構(gòu)的一個(gè)關(guān)鍵量是徑向分布函數(shù)g（r）?？紤]到單層平面中域的均勻分布，g（r）表示在選擇為參考點(diǎn)的另一個(gè)域的距離r處找到域的概率：

這里，r=N/A是數(shù)密度，N是域數(shù)，A是總單層面積，d（-r）是狄拉克δ函數(shù)，角括號(hào)表示平衡系綜平均值。

從顯微照片中，我們計(jì)算了凝聚面積分?jǐn)?shù)f，定義為域占單層面積的面積比。為此，我們確定了每個(gè)相位的數(shù)量，使用圖像處理軟件ImageJ將原始灰度圖像轉(zhuǎn)換為黑白圖像。19然后，確定黑色區(qū)域占用的總面積，該面積對(duì)應(yīng)于域占用的面積。

為了處理圖像，我們使用帶通濾波器去除了圖像中的輕微不均勻照明（由于激光束輪廓的強(qiáng)度分布）。然后，我們選擇一個(gè)特定的灰度級(jí)別，強(qiáng)度高于該閾值的所有像素被轉(zhuǎn)換為“白色”，而強(qiáng)度低于該閾值的像素被轉(zhuǎn)換為“黑色”。閾值水平的值是根據(jù)結(jié)構(gòu)的最佳分辨率，通過(guò)與原始照片進(jìn)行恒定的眼睛比較來(lái)確定的。閾值必須仔細(xì)選擇，因?yàn)樗_定了f.4的主要誤差源。不同的閾值會(huì)改變域的大小；因此，g（r）的確定不會(huì)受到顯著影響，因?yàn)樗鼉H取決于域中心的位置。然而，選擇低閾值可能導(dǎo)致低估域的數(shù)量，因?yàn)樽钚〉挠颍ㄓ蛎娣e小于4像素）看起來(lái)比較大的域輕。因此，選擇閾值是為了使域總數(shù)的修改不超過(guò)10%。

我們計(jì)算每個(gè)單層的徑向分布函數(shù)，作為域中心到中心距離r的直方圖。對(duì)于每種情況，使用1000微圖左右的數(shù)字，大小為122122 mm2，并選擇0.5 px（0.12 mm）的分塊。該尺寸大于r中的誤差，Dr=0.3 px（0.07 mm），并且足夠小，可以獲得特征良好的曲線。g（r）的誤差是使用標(biāo)準(zhǔn)差為r的每個(gè)值獨(dú)立計(jì)算的。

2.2、模擬

我們考慮在其兩相LC和LE共存區(qū)域中的單分子膜，其中LC相在LE相中形成域，占據(jù)單分子膜的較大面積。由于表面密度的差異，LC疇相對(duì)于周圍的LE相具有過(guò)量的偶極密度。20這源于域之間的偶極排斥相互作用。通常在DSPC–DMPC單分子膜中，結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)近似圓形。

我們將混合單分子膜建模為均勻?qū)?，介電常?shù)em位于兩個(gè)不同的半無(wú)限介質(zhì)（空氣和水）之間。該層由有效偶極密度s垂直于界面的單分散圓形磁疇組成。在該模型中，兩個(gè)磁疇之間產(chǎn)生的偶極對(duì)電勢(shì)Ud可以用以下公式描述：

其中Ai表示域i的面積，dai表示其面積元素，-ri表示其相對(duì)于域中心的位置向量，i=1，2-r是從域1中心到域2中心的向量，如圖1所示。e0是真空介電常數(shù)，ew和ea分別是水和空氣的相對(duì)介電常數(shù)。在這里，我們使用了Urbakh等人21的研究結(jié)果，該研究描述了由兩個(gè)半無(wú)限介質(zhì)包圍的薄電介質(zhì)層中偶極子之間的相互作用。

注意，在定義

相互作用勢(shì)Ud相當(dāng)于浸入具有有效介電常數(shù)e*的均勻介質(zhì)中的兩個(gè)磁疇的相互作用勢(shì)Ud。

圖1具有中心到中心距離R的兩個(gè)等半徑R和多余偶極密度s的域。

由該勢(shì)導(dǎo)出的作用在域1上的力為

該力沿中心線分布，其大小僅取決于域之間的距離r。Fd（r）沒(méi)有解析表達(dá)式，因此必須進(jìn)行數(shù)值計(jì)算。然而，對(duì)于單分散系統(tǒng)的特殊情況（所有域半徑等于R），Wurlitzer等人22發(fā)現(xiàn)該力的漸近行為為：

正如預(yù)期的那樣，對(duì)于較大距離，它減少到兩點(diǎn)偶極子r 4的力。這些表達(dá)式不描述實(shí)驗(yàn)相關(guān)區(qū)間（2+0.1）R 10R內(nèi)的域之間的相互作用，因此必須對(duì)等式（4）進(jìn)行數(shù)值積分。與解析表達(dá)式相比，該4D積分在模擬中代表了更多的計(jì)算工作量。這就是為什么更容易近似磁疇中心點(diǎn)偶極子的相互作用，偶極矩mi表示磁疇區(qū)域上的偶極密度，mi=sAi。然后，垂直于界面的點(diǎn)偶極子的對(duì)電勢(shì)為

域1上的相應(yīng)力為

其中，?r是（?r=-r/r）在-r方向上的酉向量。為了方便起見(jiàn)，我們定義了

表征力Fd和Fp強(qiáng)度的量。

圖2顯示了兩個(gè)半徑相等的圓形區(qū)域的Fd（r）（實(shí)線）和Fp（r）（虛線）。疊加在等式（4）的數(shù)值解上，我們添加了等式（5）（虛線）的短距離的漸近表達(dá)式。注意，當(dāng)兩個(gè)域接近接觸（r=2R）時(shí)，F(xiàn)d發(fā)散，而Fp保持有限。此外，對(duì)于實(shí)驗(yàn)感興趣的范圍2R o r o 10R，兩個(gè)力之間的差異是可觀的。特別是，即使r=5R，差值也在15%左右。

點(diǎn)偶極近似在短距離和中間距離偏離偶極密度力。因此，用兩種方案獲得的單層膜的結(jié)構(gòu)特性有顯著差異。

我們將混合單層建模為浸入有效流體中的等半徑（單分散）相互作用硬盤的二維布朗懸浮液，每個(gè)硬盤代表一個(gè)理想的脂質(zhì)域。域間相互作用由等式（2）加上硬核排斥部分給出的全偶極密度對(duì)勢(shì)來(lái)描述。同樣的系統(tǒng)也使用點(diǎn)偶極子勢(shì)方程（6）進(jìn)行了研究，以分析這種更容易實(shí)現(xiàn)的近似的有效性。

圖2以相互作用強(qiáng)度f(wàn)0為單位，具有相同半徑R的兩個(gè)域的偶極相互作用力Fd和點(diǎn)偶極近似力Fp是邊界到邊界分離R/R 2的函數(shù)。文中還給出了有限差分在短距離下的漸近表達(dá)式。

為了研究這兩種混合單層模型的靜態(tài)特性，我們進(jìn)行了布朗動(dòng)力學(xué)（BD）模擬。在該格式中，描述在時(shí)間步長(zhǎng)Dt期間浸入流體中的N個(gè)相同布朗盤的平面內(nèi)位移的有限差分方程由23給出

其中，F(xiàn)Pj是由于所有其他N 1圓盤作用在圓盤j上的直接總力，D0是圓盤擴(kuò)散系數(shù)，kB是玻爾茲曼常數(shù)，T是溫度，%Xi是源于溶劑-粒子碰撞的粒子i的隨機(jī)位移矢量。%Xi從具有零均值和協(xié)方差矩陣的高斯分布中采樣：

其中I是單位矩陣，di，j是克羅內(nèi)克三角洲。

預(yù)先計(jì)算了域間偶極密度力eqn（4），并將這些值制成表格，供以后在模擬中使用。方程（4）中的4d積分使用蒙特卡洛算法計(jì)算2.003 o r/r o 22，并且在該范圍外使用漸近線的解析表達(dá)式，方程（5）。

在周期邊界條件下，使用最小鏡像約定，模擬系統(tǒng)由半徑為R的N個(gè)磁盤組成。模擬框L的大小使用冷凝面積分?jǐn)?shù)f=NpR2/L2的表達(dá)式確定。

在我們的模擬中，我們使用由單層顯微照片確定的f，N=144個(gè)圓盤，Dt=210 4R2/D0。系統(tǒng)地改變確定系統(tǒng)的剩余參數(shù)f0，以找到與實(shí)驗(yàn)g（r）的最佳一致性。

我們驗(yàn)證了，對(duì)于所研究的系統(tǒng)，結(jié)構(gòu)量中不存在系統(tǒng)大小依賴性。通過(guò)與2D系統(tǒng)上已發(fā)布的模擬數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，針對(duì)具體示例測(cè)試了我們的BD模擬方法的準(zhǔn)確性。24